先进实验室检测技术，解开阿尔茨海默谜题的金钥匙

近期，一部热映电视剧《都挺好》再一次把俗称老年痴呆症的阿尔茨海默症推上了舆论的风口浪尖。这种主要症状表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆的神经系统退行性疾病，不仅摧毁了无数家庭的幸福，还因其病因至今仍未明确，成为了困扰临床研究领域的一大难题。

在针对阿尔茨海默症的众多病因假说中，β-淀粉样蛋白（aβ）假说是较为主流的一种。在这一假说中，编码aβ前体蛋白（APP）的APP基因作为致病基因在发生变异后，APP会被剪切为aβ，导致aβ大量累积，打破aβ的产生和消除平衡；而aβ减少后，会降低阿尔茨海默症的发生风险，因此认为aβ是导致AD发生的元凶。尽管近日某国际医药研发公司宣布其抗β-淀粉样蛋白药物的研发失败，aβ假说遭受质疑，但这一假说仍然是目前相关研究的主流方向之一。

而在β-淀粉样蛋白的相关研究中，高效地从样品（通常为人或猴脑髓液）中定量测量β-淀粉样（aβ）肽对研究至关重要。定量检测生物体液中aβ肽的传统方法主要依赖ELISA等免疫分析技术。此类分析方法不仅开发起来极为费时、成本高昂，而且操作繁琐、容易发生交叉反应，最后还必须对每种肽进行单独分析。为了满足研发的分析通量要求以及一直以来该领域对创新肽分析方法的迫切需求，需要开发出基于LC/MS/MS平台且具有高度特异性的灵活方法。

本文介绍了一种应用快速、灵活的SPE/LC/MS/MS平台为生物标志物发现研究或临床前发现研究开发了一种用于定量人或猴脑脊液（CSF）中多种β-淀粉样（aβ）肽的方法。在这一方法中，采用了沃特世公司2018年全新发布的XevoTQ-S质谱系统。这款新系统所需的样品量仅为前代产品XevoTQMS系统的1/4，且分析灵敏度提高了4~5倍。

实验条件

ACQUITYUPLC条件

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18300?，2.1x150mm，1.7m，肽分离技术专用色谱柱

部件号：186003687

柱温：50°C

样品温度：15°C

进样体积：10.0L

进样模式：部分环

流速：0.2mL/min

流动相A：0.3%氨水溶液

流动相B：90/10乙腈/流动相A

强洗针液：60：40乙腈：异丙醇+10%浓氨水（600L）

弱洗针液：90：100.3%氨水溶液：乙腈（400L）

梯度：

毛细管电压：2.5V

脱溶剂气温度：450°C

锥孔气流速：未使用

脱溶剂气流速：800L/h

碰撞室压力：2.6x10（-3）mbar

MRM通道监测（ESI+）：见表1

SPE条件样品预处理

用5M盐酸胍以1：1的比例稀释50L人CSF或加标的人造CSF+5%大鼠血浆，在室温下振摇45min。再用50L4%H3PO4水溶液进一步稀释并混合。

注：对于加标样品，样品加标后在室温下平衡30min，然后用盐酸胍稀释。

使用OasisMCX萃取样品

采用下方图2所示的方案萃取样品。所有溶液均按照体积比配制。对Elution板中盛装有样品的孔实施所有步骤。

实验结果与讨论

质谱检测

由于4+母离子碰撞诱导解离（CID）产生的几种子离子对应几种特异性b序列离子（代表性谱图见图3），因此以正离子模式进行MS检测。

XevoTQ-S同之前的XevoTQ相比灵敏度更高，因此所需样品量仅为原来的1/4，同时又将分析灵敏度提高了4~5倍。XevoTQ-S系统可检测的最低QC样品浓度比使用标准XevoTQMS系统时可检测的最低QC样品浓度还要低5倍。Rainville和Booth的早期研究（应用纪要720003415en）更详细地介绍了XevoTQ-S系统的改进，并证明使用XevoTQ-S系统分析去氨加压素（一种治疗性肽）也能实现与此类似的灵敏度提升。

仪器的质量范围也是影响分析特异性的一个重要因素。XevoTQ-SMS两个四极杆的质量范围均为2048，因此我们完全可以选择专属性更高的4+母离子和子离子对，而不是5+母离子和子离子对。

UPLC分离

三种β-淀粉样肽的分离结果如图4所示。流动相中氨水的量对于检测负离子的灵敏度影响很大，而事实证明ESI正离子模式下的信号更不易受流动相组成细微变化的影响，可保证至少24小时内的LC分析/自动进样器进样获得稳定信号。相比之下，采用ESI负离子模式时，由于流动相中的氨水浓度会自然变化（挥发），10~12小时后会丢失50%或50%以上的信号。这进一步证明了采用ESI正离子模式的MS方法的稳定性。

样品制备：SPE

使用OasisMCX（一种混合模式吸附剂）进行SPE萃取，以提高样品萃取的选择性。此吸附剂依赖于反相保留和离子交换保留机制，可以选择性地将复杂CSF样品中的aβ组分与其它高丰度多肽分离开来。使用OasisElution板（96孔板）即可浓缩样品，无需挥干和复溶。这不仅节省了时间，还能减少挥干过程中由于收集板壁吸附导致的肽损失。

在方法开发初期，萃取人造CSF时观察到了明显的非特异性结合（NSB）。因此，加入5%大鼠血浆（具有不同的β-淀粉样肽序列）进行表面结合，以消除NSB。

SPE方案是整个方法非常重要的一环。将高选择性的淀粉样肽萃取方案与高分离度的分析级UPLC相结合，我们无需使用抗体或耗费大量时间执行与ELISA方法相关的免疫沉淀步骤，就能轻松分析临床前研究样品。XevoTQ-S灵敏度更高，因此所需的CSF样品体积从200L降至50L，可满足临床前研究的需求。

结论

XevoTQ-S三重四极杆质谱仪具有更高的灵敏度，因此样品使用量仅为XevoTQMS系统的1/4，且定量限降低了4~5倍。

本研究开发并验证了一种SPE-UPLC/MS/MS生物分析方法，该方法可同时定量检测人和猴CSF中的多种β-淀粉样肽。

使用Elution板进行高选择性的混合模式SPE样品萃取，并配合高分离度的UPLC进行色谱分离，这两种技术对于我们精

准可靠地定量人和猴CSF中的3种主要β-淀粉样肽而言至关重要。

采用正离子模式MS/MS和b序列片段离子进行分析，满足了该应用对MS特异性的要求。

只需不到30min即可提取96个样品以待进样，可满足临床前和临床研究的样品制备通量要求。

本文所述的方法为临床前研究免除了耗时的免疫分析或免疫沉淀步骤。

该方法通过一次分析即可同时测定同一样品中的多种β-淀粉样肽。该方法兼具高通量以及高选择性和高特异性，同时还能提供检测低浓度内源性β-淀粉样肽所需的高灵敏度。

相较于必须使用不同抗体进行多次测定才能单独定量各种相关多肽的ELISA方法，本文介绍的方法只需使用一次UPLC/MS/MS分析，优势非常明显。